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用細胞刮刀實驗時

發(fā)布日期: 2018-09-25
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   用細胞刮刀實驗時
  實驗步驟:無菌條件下取新生小牛大腦皮層灰質部,4℃D-Hank′s液洗滌4次,至無血跡殘留。剪成1mm3左右的組織碎塊并置于玻璃勻漿器內,加入兩倍體積的MEM培養(yǎng)基,勻漿上下20次?勻漿液先用100目(直徑149μm)尼龍網(wǎng)布式漏斗抽濾,培養(yǎng)基洗滌4次,收集濾液。然后用200目(直徑74μm)尼龍網(wǎng)布式漏斗抽濾,MEM培養(yǎng)基洗滌4次。細胞刮刀收集200目尼龍網(wǎng)上的組織(即牛腦微血管),將其置于離心管中,1500r/min離心洗滌10min。離心洗滌的腦微血管懸浮于的0.1%膠原酶中,旋渦振蕩15sec以充分混勻,置于37℃恒溫振蕩水浴箱中振蕩消化50min?取出后旋渦振蕩15sec,1500r/min離心10min,棄上清,用20%BCS的培養(yǎng)基懸浮,接種于明膠鋪被的培養(yǎng)瓶中(培養(yǎng)瓶中加入1%明膠-D-Hank′s液洗滌3ml,37℃孵箱中放置24h,用前倒掉明膠溶液即得明膠覆蓋的培養(yǎng)瓶),置于細胞培養(yǎng)箱中,37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。靜置5~7天后,可見少量細胞生長,20%BCS的MEM培養(yǎng)液換液,以后每2~3天換液一次,至細胞長成致密單層后可傳代培養(yǎng)。
  1、提前準備好Matrigel(BD 354277)包被過的六孔板,吸棄孔內包被液,加入2ml BeYaMATM 1*培養(yǎng)液。
  2、吸棄待傳代hESCs/hiPSCs孔內的培養(yǎng)液,并用1ml無鈣鎂的PBS洗1遍。
  3、加入0.5ml Accutase細胞分離液使之*覆蓋皿底。
  4、室溫孵育5-8分鐘或37℃孵育3-5分鐘,顯微鏡下觀察到大部分克隆細胞間出現(xiàn)間隙,細胞表面發(fā)亮但尚未相互分離時,可吸去Accutase。
  5、可將培養(yǎng)板放置37℃繼續(xù)孵育1min,或者直接加入適量新鮮BeYaMATM 1*培養(yǎng)液,輕輕搖晃,干細胞集落基本脫落。亦可用細胞刮刀將剩余克隆輕輕刮下,盡量避免用槍頭反復吹打細胞。
  6、將制備好的細胞懸液按1:3-1:6的比例接種至準備好的培養(yǎng)板中,注意細胞過密則克隆邊界不圓滑,易分化,細胞過稀則克隆存活率降低。
  7、輕輕搖晃培養(yǎng)板讓細胞均勻分散,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時。
  8、每天更換培養(yǎng)液,待細胞密度達到80%以上,或者克隆中央密度過大,影響細胞生長時進行傳代。
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